- Oggetto:
- Oggetto:
LABORATORIO DI METODOLOGIE BIOCHIMICHE E MICROBIOLOGICHE
- Oggetto:
LABORATORY OF METHODS IN BIOCHEMISTRY AND MICROBIOLOGY
- Oggetto:
Anno accademico 2014/2015
- Codice dell'attività didattica
- MFN0415
- Docenti
- Dott. Francesca Valetti
Dott. Maria Elena Terlizzi - Corso di studi
- Scienze Biologiche D.M. 270
- Anno
- 3° anno
- Periodo didattico
- I semestre
- Tipologia
- Caratterizzante
- Crediti/Valenza
- 8
- SSD dell'attività didattica
- BIO/10 - biochimica
BIO/19 - microbiologia generale - Modalità di erogazione
- Tradizionale
- Lingua di insegnamento
- Italiano
- Modalità di frequenza
- Lezioni facoltative e esercitazioni obbligatorie
- Tipologia d'esame
- Scritto
- Prerequisiti
- _
- Propedeutico a
- Attività professionalizzante di laboratorio e propedeutico ad attività di
approfondimento nel settore biochimico e biomolecolare per le LM - Oggetto:
Sommario insegnamento
- Oggetto:
Obiettivi formativi
L’allievo dovrà dimostrare di conoscere le tecniche di base e le strategie di:
• estrazione di molecole biologiche da tessuti e cellule, cromatografia, elettroforesi, spettroscopia applicata allo studio delle molecole biologiche
• purificazione di proteine ed enzimi mantenendo l’integrità strutturale e funzionale
• analisi e dosaggio di macromolecole biologiche, in particolare di proteine, e di piccole molecole di interesse biologico, in particolare coenzimi, substrati e prodotti di reazioni enzimatiche.The student should be able to know the principle and the techniques for:
• extraction of proteins and other macromolecules from cells and
tissues, chromatography, electrophoresis, spectroscopy applied to
macromolecules studies
• proteine and enzyme purificatin in native conditions and activity
(structure and function integrity and activity check)
• analysis and quantification of biological macromolecules (mainly
protein) and of small moleculesof biological interest, namely cofactors
and coenzymes, substrates and products of enzyme reactions- Oggetto:
Risultati dell'apprendimento attesi
_
- Oggetto:
Modalità di verifica dell'apprendimento
Relazione di laboratorio (20 h) svolta in gruppo e esame scritto con problemi e domande semistrutturate.
Written essay on the lab practicals (20 h) and written exam with
experimental problems to be solved and multiple choice test on technical
details of studied methods.Scritto articolato in domande semi-strutturate e discussione orale di protocolli sperimentali con valutazione e di-scussione critica delle attività di laboratorio. Nella sessione estiva (giugno-luglio) gli appelli saranno SCRITTI. Nelle altre sessioni tutti gli appelli saranno ORALI.
- Oggetto:
Programma
Introduzione: la cellula come unità funzionale e composti biologici da analizzare e caratterizzare. Condizioni da rispettare in vitro (Ph, forza ionica, condizioni redox, viscosità, ecc.)
Soluzioni tampone: calcoli e preparazione con esempi in aula
Tecniche di estrazione di macromolecole: tessuti animale e vegetali (tecniche di omogeneizzazione), organismi monocellulari (colture microbiche). Metodi di recupero di proteine esocellulari, endocellulari e di membrana. Tecniche di lisi di pareti e membrane. Proteine espresse in sistemi diversi da quello naturale.
Solubilità delle proteine e tecniche di precipitazione. Centrifugazione e ultracentrifugazione: applicazioni per tecniche preparative e cenni alle applicazioni analitiche. Filtrazione, dialisi, concentrazione del campione.
Congelamento e liofilizzazione. Cenni ai metodi di cristallizzazione di proteine: allestimento di screening, condizioni, metodi diffusione di vapore con hanging drop, sitting drop, sandwich drop.
Utilizzo di tecniche spettrofotometriche, richiamo alla legge di Lambert- Beer.
Saggi colorimetrici di uso comune. Metodi di dosaggio proteico e di valutazione dell’attività enzimatica.
Tecniche cromatografiche: cromatografia su strato sottile. Matrici cromatografiche per LC, FPLC, HPLC, vantaggi e svantaggi d’uso e applicazioni. Cromatografie su colonna: scambio ionico, interazioni idrofobiche, gel filtrazione, affinità (con eserc. pratica), cromatofocusing.
HPLC, FPLC, gas-cromatografie. Esempi di applicazione tramite la presentazione di dati sperimentali.
Tecniche elettroforetiche, SDS-PAGE (con esercitazione pratica 4h), isoelettrofocalizzazione, elettroforesi bidimensionale, tecniche di densitometria, elettroeluizione, blotting ed elettroblotting. Colorazioni specifiche e aspecifiche per elettroforesi di proteine e glicoproteine.
Western blotting e immunodecorazione (con esercitazione pratica 4h), sistemi di marcatura mediante avidina-biotina, perossidasi da rafano e fosfatasi alcalina
Composizione in aminoacidi di una proteina. Struttura primaria: degradazione di Edman. Sequenze N- terminali e sequenze interne.
Scelta delle proteasi
Cenni alle tecniche di spettrometria di massa (PMF con Maldi, ESI-Ion trap)
Utilizzo di tecniche spettroscopiche in biochimica per studi teorici e applicazioni (dicroismo circolare, fluorescenza, NMR, EPR, spettroscopia di assorbimento atomico, IR, Raman) con basi elementari della tecnica e enfasi sulle informazioni ottenibili da ciascuna tecnica tramite numerosi esempi.
Discussione in aula ed analisi di dati sperimentali ottenuti con alcune tecniche illustrate.
Tecniche elettrochimiche di base: elettrodi utilizzati (pHmetro, elettrodi reference, elettrodo di Clark, ossigrafo ed altri gas-sensitive electrodes).
Legge e curve di Nernst: esempi di titolazioni spettroelettrochimiche.
Cenni all’interazione elettrodi-proteine e alla voltammetria ciclica. Esempi applicativi di protocolli con esercitazioni.Sample preparation for biochemical analysis, protein compatible buffers
and detergents. Purification of intracellular and extracellular proteins.
Protein solubility and precipitation techniques. Filtration, dialysis, crystals
of proteins: screening, conditins, vapour diffusion methods by hanging
d r o p , s i t t i n g d r o p , s a n d w i c h d r o p . L a m b e r t - b e e r l a w a n d
spectrophotometric assays for protein quantitation (Lowry, Bradford,
Bicinchonic Acid ) and for enzyme activity.
Chromatography: IEXC, gel filtration. HPLC, FPLC, gas-cromatography.
Analysis of experimental data. Cutting-edge chromatography techniques
for protein purification (affinity chromatography),. Electrophoresis
techniques for purity check. PAGE, IEF and 2D electrophoresis for
proteomics. Protein blotting and decoration ( avidin-biotin, peroxidase,
phosphatesa): specific stainig for glycoproteins. Protein primary structure
analysis: proteases digestion, protein sequencing methods with Edman
reaction. Brief overview on Maldi, ESI-Ion trap MS and MS/MS methods for
peptide fingerprinting and de novo sequencing.. Spectroscopy for protein
2ary and 3ary structure studies (CD, fluorescence, NMR, EPR, AS, IR,
Raman): application and basis of structural/functional data obtained.
Discussion on experimental protocols with practicals on data analysis.
Electrochemical techniques: electrodes (pHmeter, refernce electrode,
Clark electrode). Nernst law and plot: spectroelectrochemical titration.
Brief discussion on protein-electrode interactions.
Lab practicals: Recombinant protein expression systems. purification of a
GST-tag fusion protein, enzyme activity assay by spectrophotometric
methods. SDS-PAGE, western blotting, protein quantitation and
discussion on characterisation techniques by spectrophotometric
advanced methods.Testi consigliati e bibliografia
- Oggetto:
Il materiale didattico presentato a lezione è disponibile sul sito del corso.
testi consigliati:
A.J. Ninfa, D.P. Ballou. Metodologie di base per la biochimica e la biotecnologia. Zanichelli (2000).
IC Wilson, J. Walker. Metodologia biochimica: le tecniche biochimiche in laboratorio. Ed. Raffaello Cortina (1995).
R.L. Dryer, G.F. Lata. Metodologia biochimica Ed. Delfino (1993).
Murray et al., Microbiologia, EMSI, 2008.
Madigan et al., Brock – Biologia dei Microrganismi, Vol. 2A e 2B, Casa Editrice Ambrosiana, 2007.Slides, protocols and technical details are available i+ìon the course
website
Reference textbooks:
A.J. Ninfa, D.P. Ballou. Metodologie di base per la biochimica e la
biotecnologia. Zanichelli (2000).
IC Wilson, J. Walker. Metodologia biochimica: le tecniche biochimiche in
laboratorio. Ed. Raffaello Cortina (1995).
R.L. Dryer, G.F. Lata. Metodologia biochimica Ed. Delfino (1993).
Murray et al., Microbiologia, EMSI, 2008.
Madigan et al., Brock – Biologia dei Microrganismi, Vol. 2A e 2B, Casa
Editrice Ambrosiana, 2007.- Oggetto:
Note
Curriculum Cellulare Biomolecolare, curriculum Tecnico Analitico
- Oggetto:
Moduli didattici
- METODOLOGIE BIOCHIMICHE (MFN0415B)
- MICROBIOLOGIA APPLICATA (MFN0415A)
- Oggetto:
