- Oggetto:
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Metodologie biochimiche
- Oggetto:
Anno accademico 2012/2013
- Codice dell'attività didattica
- MFN0415B
- Docenti
- Prof. Francesca Valetti
Dott. Giovanna Di Nardo - Insegnamento integrato
- Crediti/Valenza
- 4
- SSD dell'attività didattica
- BIO/10 - biochimica
- Oggetto:
Sommario insegnamento
- Oggetto:
Programma
Introduzione: la cellula come unità funzionale e composti biologici da analizzare e caratterizzare. Condizioni da rispettare in vitro (Ph, forza ionica, condizioni redox, viscosità, ecc…) Soluzioni tampone: calcoli e preparazione con esempi in aula
Tecniche di estrazione di macromolecole: tessuti animale e vegetali (tecniche di omogeneizzazione), organismi monocellulari (colture microbiche). Metodi di recupero di proteine esocellulari, endocellulari e di membrana. Tecniche di lisi di pareti e membrane. Proteine espresse in sistemi diversi da quello naturale.
Solubilità delle proteine e tecniche di precipitazione. Centrifugazione e ultracentrifugazione: applicazioni per tecniche preparative e cenni alle applicazioni analitiche. Filtrazione, dialisi, concentrazione del campione. Congelamento e liofilizzazione. Cenni ai metodi di cristallizzazione di proteine: allestimento di screening, condizioni, metodi diffusione di vapore con hanging drop, sitting drop, sandwich drop.
Utilizzo di tecniche spettrofotometriche, richiamo alla legge di Lambert-Beer.
Saggi colorimetrici di uso comune. Metodi di dosaggio proteico e di valutazione dell’attività enzimatica.
Tecniche cromatografiche: cromatografia su strato sottile. Matrici cromatografiche per LC, FPLC, HPLC, vantaggi e svantaggi d’uso e applicazioni. Cromatografie su colonna: scambio ionico, interazioni idrofobiche, gel filtrazione, affinità (con eserc. pratica), cromatofocusing. HPLC, FPLC, gas-cromatografie. Esempi di applicazione tramite la presentazione di dati sperimentali.
Tecniche elettroforetiche, SDS-PAGE (con esercitazione pratica 4h), isoelettrofocalizzazione, elettroforesi bidimensionale, tecniche di densitometria, elettroeluizione, blotting ed elettroblotting. Colorazioni specifiche e aspecifiche per elettroforesi di proteine e glicoproteine. Western blotting e immunodecorazione (con esercitazione pratica 4h), sistemi di marcatura mediante avidina-biotina, perossidasi da rafano e fosfatasi alcalina
Composizione in aminoacidi di una proteina. Struttura primaria: degradazione di Edman. Sequenze N- terminali e sequenze interne. Scelta delle proteasi
Cenni alle tecniche di spettrometria di massa (PMF con Maldi, ESI-Ion trap)
Utilizzo di tecniche spettroscopiche in biochimica per studi teorici e applicazioni (dicroismo circolare, fluorescenza, NMR, EPR, spettroscopia di assorbimento atomico, IR, Raman) con basi elementari della tecnica e enfasi sulle informazioni ottenibili da ciascuna tecnica tramite numerosi esempi. Discussione in aula ed analisi di dati sperimentali ottenuti con alcune tecniche illustrate.
Tecniche elettrochimiche di base: elettrodi utilizzati (pHmetro, elettrodi reference, elettrodo di Clark, ossigrafo ed altri gas-sensitive electrodes). Legge e curve di Nernst: esempi di titolazioni spettroelettrochimiche. Cenni all’interazione elettrodi-proteine e alla voltammetria ciclica. Esempi applicativi di protocolli con esercitazioni
Sample preparation for biochemical analysis, protein compatible buffers and detergents. Purification of intracellular and extracellular proteins. Protein solubility and precipitation techniques. Filtration, dialysis, crystals of proteins: screening, conditins, vapour diffusion methods by hanging drop, sitting drop, sandwich drop. Lambert-beer law and spectrophotometric assays for protein quantitation (Lowry, Bradford, Bicinchonic Acid ) and for enzyme activity.
Chromatography: IEXC, gel filtration. HPLC, FPLC, gas-cromatography. Analysis of experimental data. Cutting-edge chromatography techniques for protein purification (affinity chromatography),. Electrophoresis techniques for purity check. PAGE, IEF and 2D electrophoresis for proteomics. Protein blotting and decoration ( avidin-biotin, peroxidase, phosphatesa): specific stainig for glycoproteins. Protein primary structure analysis: proteases digestion, protein sequencing methods with Edman reaction. Brief overview on Maldi, ESI-Ion trap MS and MS/MS methods for peptide fingerprinting and de novo sequencing.. Spectroscopy for protein 2ary and 3ary structure studies (CD, fluorescence, NMR, EPR, AS, IR, Raman): application and basis of structural/functional data obtained. Discussion on experimental protocols with practicals on data analysis. Electrochemical techniques: electrodes (pHmeter, refernce electrode, Clark electrode). Nernst law and plot: spectroelectrochemical titration. Brief discussion on protein-electrode interactions.
Lab practicals: Recombinant protein expression systems. purification of a GST-tag fusion protein, enzyme activity assay by spectrophotometric methods. SDS-PAGE, western blotting, protein quantitation and discussion on characterisation techniques by spectrophotometric advanced methods.
La finalità del corso consiste nel fornire agli studenti un quadro teorico e operativo di alcune delle principali applicazioni della Microbiologia in campo biomedico, industriale e ambientale e la conoscenza teorico-pratica delle più importanti metodologie di estrazione, purificazione, caratterizzazione strutturale e catalitica delle proteine, nonché delle più recenti tecniche applicative. L’allievo dovrà essere in grado di orientarsi correttamente sulla scelta delle procedure da utilizzare (ed essere consapevole dei limiti delle stesse).
Al termine del corso gli studenti dovranno possedere:
• una buona conoscenza dei principali batteri patogeni per l’uomo;
• una buona conoscenza degli elementi di diagnostica batteriologica;
• una buona conoscenza dell’impiego dei microrganismi nei processi industriali;
• una buona conoscenza dell’utilizzo dei batteri nei processi di biorisanamento ambientale.
L’allievo dovrà dimostrare di conoscere le tecniche di base e le strategie di:
• estrazione di molecole biologiche da tessuti e cellule, cromatografia, elettroforesi, spettroscopia applicata allo studio delle molecole biologiche
• purificazione di proteine ed enzimi mantenendo l’integrità strutturale e funzionale
• analisi e dosaggio di macromolecole biologiche, in particolare di proteine, e di piccole molecole di interesse biologico, in particolare coenzimi, substrati e prodotti di reazioni enzimatiche.
Il materiale didattico presentato a lezione è disponibile su CD distribuito a inizio anno agli studenti (eventualmente su richiesta al docente in ulteriori copie).
A.J. Ninfa, D.P. Ballou. Metodologie di base per la biochimica e la biotecnologia. Zanichelli (2000).
IC Wilson, J. Walker. Metodologia biochimica: le tecniche biochimiche in laboratorio. Ed. Raffaello Cortina (1995).
R.L. Dryer, G.F. Lata. Metodologia biochimica Ed. Delfino (1993).
Murray et al., Microbiologia, EMSI, 2008.
Madigan et al., Brock – Biologia dei Microrganismi, Vol. 2A e 2B, Casa Editrice Ambrosiana, 2007.
Materiale didattico e integrativo fornito a lezione (appunti e CD-rom contenente il materiale didattico utilizzato per le lezioni e le esercitazioni).
Infine sono di seguito indicati siti internet di interesse:
http://www.expasy.ch/
http://www.biology.arizona.edu/biochemistry/biochemistry.html
Scritto e orale congiunti.
Scritto articolato in domande semi-strutturate e discussione orale di protocolli sperimentali con valutazione e discussione critica delle attività di laboratorio.
La frequenza alle lezioni non è obbligatoria; per i corsi di laboratorio e le attività di esercitazione relative ai corsi la frequenza è obbligatoria e non può essere inferiore al 70% delle ore previste.Testi consigliati e bibliografia
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