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Oggetto:
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Laboratorio di Metodologie Biochimiche e Microbiologiche

Oggetto:

Laboratory of Methods in Biochemistry and Microbiology

Oggetto:

Anno accademico 2013/2014

Codice dell'attività didattica
MFN0415
Docenti
Prof. Francesca Valetti
Dott. Maria Elena Terlizzi
Corso di studi
Scienze Biologiche D.M. 270
Anno
3° anno
Periodo didattico
I semestre
Tipologia
Affine o integrativo
Crediti/Valenza
8
SSD dell'attività didattica
BIO/10 - biochimica
BIO/19 - microbiologia generale
Modalità di erogazione
Tradizionale
Lingua di insegnamento
Italiano
Modalità di frequenza
Obbligatoria
Tipologia d'esame
Scritto ed orale
Modalità d'esame
Scritto articolato in domande semi-strutturate e discussione orale di protocolli sperimentali con valutazione e di-scussione critica delle attività di laboratorio.
Prerequisiti
Conoscenza dei principi di fisica e chimica generale
conoscenza dei principi di chimica delle macromolecole biologiche
conoscenza della struttura e fisiologia della cellula procariota ed eucariota
Nozioni di Microbiologia Generale
Nozioni di Biologia Molecolare
Nozioni di Immunologia
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Sommario del corso

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Obiettivi formativi

La  finalità del corso consiste nel fornire agli studenti un quadro teorico e operativo di alcune delle principali applicazioni della Microbiologia in campo biomedico, industriale e ambientale e la conoscenza teorico-pratica delle più importanti metodologie di estrazione, purificazione, caratterizzazione strutturale e catalitica delle proteine, nonché delle più recenti tecniche applicative. L’allievo dovrà essere in grado di orientarsi correttamente sulla scelta delle procedure da utilizzare (ed essere consapevole dei limiti delle stesse).

 

 Al termine del corso gli studenti dovranno possedere:

  • una buona conoscenza dei principali batteri patogeni per l’uomo;
  • una buona conoscenza degli elementi di diagnostica batteriologica;
  • una buona conoscenza dell’impiego dei microrganismi nei processi industriali;
  • una buona conoscenza dell’utilizzo dei batteri nei processi di biorisanamento ambientale.

L’allievo dovrà dimostrare di conoscere le tecniche di base e le strategie di:

  • estrazione di molecole biologiche da tessuti e cellule, cromatografia, elettroforesi, spettroscopia applicata allo studio delle molecole biologiche
  • purificazione di  proteine ed enzimi mantenendo l’integrità strutturale e funzionale
  • analisi e dosaggio di macromolecole biologiche, in particolare di proteine, e di piccole molecole di interesse biologico, in particolare coenzimi, substrati e prodotti di reazioni enzimatiche.

 

Oggetto:

Risultati dell'apprendimento attesi

CONOSCENZA E CAPACITÀ DI COMPRENSIONE
Aspetti chimici/biochimici, Biologia dei microrganismi

CAPACITÀ DI APPLICARE CONOSCENZA E COMPRENSIONE
Metodologie biochimiche, biomolecolari e biotecnologiche
Analisi biologiche e biomediche    
Analisi microbiologiche e tossicologiche     
Procedure metodologiche e strumentali ad ampio spettro per la ricerca biologica

AUTONOMIA DI GIUDIZIO
Valutazione e interpretazione di dati sperimentali di laboratorio
Sicurezza in laboratorio
Valutazione della didattica

ABILITÀ COMUNICATIVE
Comunicazione in  lingua italiana e straniera (inglese)  scritta e orale 
Elaborazione e presentazione dati
Capacità di lavorare in gruppo

 

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Programma

METODOLOGIE BIOCHIMICHE
Introduzione: la cellula come unità funzionale e composti biologici da analizzare e caratterizzare. Condizioni da rispettare in vitro (Ph, forza ionica, condizioni redox, viscosità, ecc…) Soluzioni tampone: calcoli e preparazione con esempi in aula
Tecniche di estrazione di macromolecole: tessuti animale e vegetali (tecniche di omogeneizzazione), organismi monocellulari (colture microbiche). Metodi di recupero di proteine esocellulari, endocellulari e di membrana. Tecniche di lisi di pareti e membrane. Proteine espresse in sistemi diversi da quello naturale.
Solubilità delle proteine e tecniche di precipitazione. Centrifugazione e ultracentrifugazione: applicazioni per tecniche preparative e cenni alle applicazioni analitiche. Filtrazione, dialisi, concentrazione del campione. Congelamento e liofilizzazione. Cenni ai metodi di cristallizzazione di proteine: allestimento di  screening, condizioni,  metodi diffusione di vapore con hanging drop, sitting drop, sandwich drop.
Utilizzo di tecniche spettrofotometriche, richiamo alla legge di Lambert-Beer.
Saggi colorimetrici di uso comune. Metodi di dosaggio proteico e di valutazione dell’attività enzimatica.
Tecniche cromatografiche: cromatografia su strato sottile. Matrici cromatografiche per LC, FPLC, HPLC, vantaggi e svantaggi d’uso e applicazioni. Cromatografie su colonna: scambio ionico, interazioni idrofobiche, gel filtrazione, affinità (con eserc. pratica), cromatofocusing. HPLC, FPLC, gas-cromatografie. Esempi di applicazione tramite la presentazione di dati sperimentali.
Tecniche elettroforetiche, SDS-PAGE (con esercitazione pratica 4h), isoelettrofocalizzazione, elettroforesi bidimensionale, tecniche di densitometria, elettroeluizione, blotting ed elettroblotting. Colorazioni specifiche e aspecifiche per elettroforesi di proteine e glicoproteine. Western blotting e immunodecorazione (con esercitazione pratica 4h), sistemi di marcatura mediante avidina-biotina, perossidasi da rafano e fosfatasi alcalina
Composizione in aminoacidi di una proteina. Struttura primaria: degradazione di Edman. Sequenze N- terminali e sequenze interne. Scelta delle proteasi
Cenni alle tecniche di spettrometria di massa (PMF con Maldi, ESI-Ion trap)
Utilizzo di tecniche spettroscopiche in biochimica per studi teorici e applicazioni (dicroismo circolare, fluorescenza, NMR, EPR, spettroscopia di assorbimento atomico, IR, Raman) con  basi elementari della tecnica e enfasi sulle informazioni ottenibili da ciascuna tecnica tramite numerosi esempi. Discussione in aula ed analisi di dati sperimentali ottenuti con alcune tecniche illustrate.
Tecniche elettrochimiche di base: elettrodi utilizzati (pHmetro, elettrodi reference, elettrodo di Clark, ossigrafo ed altri gas-sensitive electrodes). Legge e curve di Nernst: esempi di titolazioni spettroelettrochimiche. Cenni all’interazione elettrodi-proteine e alla voltammetria ciclica. Esempi applicativi di protocolli con esercitazioni

MICROBIOLOGIA APPLICATA
Introduzione: campi di interesse della microbiologia applicata –  cenni storici.
Diagnostica convenzionale, diagnostica molecolare, immunodiagnostica delle malattie infettive ad eziologia batterica.
Esercitazioni di laboratorio: allestimento di colture batteriche e determinazione di fenotipi metabolici; identificazione di specie batteriche con sistema miniaturizzato;  determinazione quantitativa di popolazioni microbiche.
I principali batteri patogeni (eziologia, patogenesi, accertamento diagnostico): Stafilococchi-Streptococchi-Clostridi-Bacillus- Brucelle-Micobatteri-Corinebatteri-Enterobatteri-Vibrioni-Spirochete-Rickettsie-Neisserie-Chlamydia-Helicobacter-Campylobacter
Dall’identificazione alla pianificazione ed al monitoraggio della terapia. Gli agenti antimicrobici. Dosaggio microbiologico degli antibiotici.
Produzione biotecnologia di strumenti diagnostici e terapeutici. Sviluppo di biosensori per applicazioni biomediche.  
Applicazioni in campo industriale. Prodotti e processi di microrganismi industriali.
Applicazioni in campo ambientale. Utilizzo dei batteri nei processi di biorisanamento

 


Sample preparation for biochemical analysis, protein compatible buffers and detergents. Purification of intracellular and extracellular proteins. Protein solubility and precipitation techniques. Filtration, dialysis, crystals of proteins: screening, conditins, vapour diffusion methods  by hanging drop, sitting drop, sandwich drop. Lambert-beer law and spectrophotometric assays for protein quantitation (Lowry, Bradford, Bicinchonic Acid ) and for enzyme activity.
Chromatography: IEXC, gel filtration. HPLC, FPLC, gas-cromatography. Analysis of experimental data. Cutting-edge chromatography techniques for protein purification (affinity chromatography),. Electrophoresis techniques for purity check. PAGE, IEF and 2D electrophoresis for proteomics. Protein blotting and decoration ( avidin-biotin, peroxidase, phosphatesa): specific stainig for glycoproteins. Protein primary structure analysis: proteases digestion, protein sequencing methods with Edman  reaction. Brief overview on Maldi, ESI-Ion trap MS and MS/MS methods for peptide fingerprinting and de novo sequencing.. Spectroscopy for protein 2ary and 3ary structure studies (CD, fluorescence, NMR, EPR, AS, IR, Raman): application and basis of structural/functional data obtained. Discussion on experimental protocols with practicals on data analysis. Electrochemical techniques: electrodes (pHmeter, refernce electrode, Clark electrode). Nernst law and plot: spectroelectrochemical titration. Brief discussion on protein-electrode interactions.

Lab practicals: Recombinant protein expression systems. purification of a GST-tag fusion protein, enzyme activity assay by spectrophotometric methods. SDS-PAGE, western blotting, protein quantitation and discussion on characterisation techniques by spectrophotometric advanced methods.

Introduction: applied microbiology fields of interest. Diagnostic methods: growth-dependent identification, immunoassays, nucleic acid methods. Pathogenic bacteria (general concepts, pathogenesis, diagnosis): Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium, Bacillus, Brucella, Mycobacterium, Corynebacterium, Enterobacteria,Vibrio- Spirochaeta-Rickettsia- Neisseria-Chlamydia-Helicobacter-Campylobacter. Antimicrobial agents: from the identification of new molecules to the application in clinical trials. Production of diagnostic and therapeutic tools: development of biosensors for biomedical applications. Industrial micro-organism products and products formation. Applications of Bacteria in the environmental field: usage in bioremediation processes.

Laboratory work: plate count agar method for the determination of viable bacteria, identification of Enterobacteriaceae with API20E kit, growth of clinical isolates on selective and differential media.

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Testi consigliati e bibliografia

Il materiale didattico presentato a lezione è disponibile su CD distribuito a inizio anno agli studenti (eventualmente su richiesta al docente in ulteriori copie).

A.J. Ninfa, D.P. Ballou. Metodologie di base per la biochimica e la biotecnologia. Zanichelli (2000).
IC Wilson, J. Walker. Metodologia biochimica: le tecniche biochimiche in laboratorio. Ed. Raffaello Cortina (1995).
R.L. Dryer, G.F. Lata. Metodologia biochimica Ed. Delfino (1993).
Murray et al., Microbiologia, EMSI, 2008.
Madigan et al., Brock – Biologia dei  Microrganismi, Vol. 2A e 2B, Casa Editrice Ambrosiana, 2007.

E’ fortemente consigliato l’utilizzo del seguente materiale per approfondimenti e integrazioni:

Materiale didattico e integrativo fornito a lezione (appunti e CD-rom contenente il materiale didattico utilizzato per le lezioni e le esercitazioni).


Infine sono di seguito indicati siti internet di interesse:

http://www.expasy.ch/
http://www.biology.arizona.edu/biochemistry/biochemistry.html

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Note

Curriculum Biomolecolare Cellulare, Curriculum Tecnico Analitico.

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Moduli didattici

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Ultimo aggiornamento: 26/06/2014 14:11
Location: https://biologia.campusnet.unito.it/robots.html
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