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METODOLOGIE BIOCHIMICHE

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METHODS IN BIOCHEMISTRY

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Anno accademico 2018/2019

Codice dell'attività didattica
MFN0415B
Docente
Dott. Francesca Valetti (Titolare)
Insegnamento integrato
Corso di studi
Scienze Biologiche D.M. 270
Anno
3° anno
Tipologia
Propedeutico
Crediti/Valenza
4
SSD dell'attività didattica
BIO/10 - biochimica
Modalità di erogazione
Tradizionale
Lingua di insegnamento
Italiano
Modalità di frequenza
Lezioni facoltative e esercitazioni obbligatorie
Tipologia d'esame
Scritto
Prerequisiti

Conoscenze inerenti alla struttura base delle proteine e degli enzimi. Tali conoscenze sono fornite attraverso l'insegnamento Biochimica (secondo anno-MFN1365-)

Proteins and enzymes structure. This knowledge is provided by Biochemistry course (second year-MFN1365-)

Propedeutico a

Attività professionalizzante di laboratorio, propedeutica per l'approfondimento nel settore biochimico e biomolecolare per le lauree magistrali.

Professionalizing for laboratory activities. Preparatory for biochemical and biomolecular degree courses.
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Sommario insegnamento

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Obiettivi formativi

La  finalità dell'insegnamento consiste nel fornire agli studenti un quadro teorico e pratico di alcune delle principali metodologie biochimiche attualmente impiegate in diversi campi tra cui quello industriale, biomedico e ambientale attraverso lezioni teorico-pratiche ed esperienze di laboratorio.

Nel dettaglio verranno fornite le basi per la conoscenza teorico-pratica delle più importanti metodologie di:

- Estrazione;

- Purificazione;

- Caratterizzazione strutturale e catalitica delle proteine e approfondimento delle più recenti tecniche applicative. 

The course gives a general overview of the main methodologies and techniques in biochemistry. The fields of application are industrial, clinical, and environmental.  Lectures and lab practicals are devoted to prepare the students to applicative approaches and to lab activity.

Theoretical and practical basis of:

- Protein extraction;

- Purification;

- Structural/functional enzyme characterisation and most advanced protein studies methods.

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Risultati dell'apprendimento attesi

Al termine dell’insegnamento lo studente dovrà dimostrare di possedere:

CONOSCENZA E CAPACITÀ DI COMPRENSIONE                                                         

L’allievo dovrà essere in grado di orientarsi correttamente sulla scelta delle procedure biochimiche per l’analisi e la purificazione di macromolecole da utilizzare in laboratorio (ed essere consapevole dei limiti delle stesse). Le tecniche illustrate nel modulo biochimico sono quelle di base applicabili in molti laboratori non strettamente dedicati alla biochimica delle proteine.

 

 CAPACITÀ DI APPLICARE CONOSCENZA E COMPRENSIONE                  

Al termine delle lezioni e delle attività di laboratorio, lo studente dovrà dimostrare le seguenti capacità:

- Saper scegliere i protocolli per estrarre molecole biologiche da tessuti e cellule;

- Saper selezionare le metodologie e applicare cromatografia, elettroforesi, spettroscopia allo studio delle molecole biologiche; 

- Purificare proteine ed enzimi mantenendo l’integrità strutturale e funzionale;

- Analizzare e dosare macromolecole biologiche, in particolare proteine, e piccole molecole di interesse biologico, in particolare coenzimi, substrati e prodotti di reazioni enzimatiche;

- Allestire semplici saggi di misura dell’attività enzimatica e valutare il corretto inserimento nella apoproteina di cofattori vitaminici e metallici.

 Competenze trasversali di laboratorio

- Svolgere rapidamente calcoli di diluizione, molarità,  equazioni dimensionali applicate in laboratorio;

- Gestire indipendentemente lo spazio, il tempo e l’ordine della propria postazione di lavoro e del materiale comune;

- Gestire consapevolmente la sicurezza in laboratorio, anche attraverso la pratica di attività a rischio (cappa chimica, acidi, uso di sostanze classificate es. acrilammide);

- Affrontare l’utilizzo di apparecchiature scientifiche complesse (spettrofotometro, HPLC, elettroforesi).

 AUTONOMIA DI GIUDIZIO                                                                                              

Lo studente dovrà dimostrare autonomia di giudizio e valutazione dei risultati sperimentali ottenuti in laboratorio grazie al confronto con il proprio team di lavoro e alle competenze tecnico-scientifiche acquisite.     

ABILITÀ COMUNICATIVE                                                                                                   

Acquisizione di competenze inerenti alla comunicazione dei risultati sperimentali mediante l’utilizzo di un linguaggio tecnico-scientifico adeguato. Capacità di lavorare in team, analizzando le criticità operative riscontrate e adottando misure di correzione condivise e appropriate.

Students must acquire the following:

 KNOWLEDGE & UNDERSTANDING

Main lab techniques in biochemistry for analysis and purification of macromolecules with a focus on proteins and enzymes. The biochemistry methods cover the basics used in any molecular biology labs. 

APPLYING KNOWLEDGE & UNDERSTANDING

- Choosing protocols for macromolecules and protein extraction from cells and tissues;

- Methodology selection and application of chromatography, electrophoresis and spectroscopy to biological molecules studies;

- Proteins and enzymes purification maintaining structural/functional properties;

- Analysis and quantitation of macromolecules and small molecules of biological interest (coenzymes, substrates and products of enzyme reaction);

- Setting simple enzyme activity assays and evaluating vitamin and metal cofactor insertion into the apoprotein.

Interdisciplinary Lab Skills

- Calculating dilutions, molarity,  dimensional equations for lab applications;

- Space/time organization of lab work. Maintenance of own workstation and management/cleaning of common glass and plasticware;

 - Safety in lab with real practice of risks:  classified chemicals, chemical fume hood;

- Usage of complex instruments (spectrophotometer, HPLC, electrophoresis).

 

 INDIPENDENCE IN JUDGMENT

Judgment of experimental results is required, as well as team work discussion and dealing with the distribution of technical/scientific competences and responsibilities.

 

COMMUNICATION SKILLS

 Students will be required to demonstrate an adequate technical and scientific lexical richness to expose the experimental results. Team work will be encouraged and promoted via the evaluation of the capacity of sharing competences, discussing criticality and adopting corrective strategies. 

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Modalità di insegnamento

L’insegnamento nella sua totalità prevede lezioni frontali in aula e attività di laboratorio volte all’approfondimento pratico delle nozioni impartite.

Il modulo si articola in 18 ore di lezione, 20 ore di laboratorio (5 incontri di 4 ore) su un progetto complessivo di purificazione  e caratterizzazione di una proteina ricombinante (su cui è richiesto lo svolgimento di una relazione oggetto di valutazione) e 8 ore (2 incontri da 4 ore) di laboratorio open day con esperienze guidate ma organizzate e gestite dagli studenti.

La frequenza alle lezioni ed esercitazioni in aula è facoltativa, la frequenza ai laboratori è raccomandata al 100% (eventuali sovrapposizioni con concomitanti insegnamenti, laboratori, esoneri verranno tenute in considerazione nella pianificazione del calendario delle attività) e non potrà comunque essere inferiore al 75% come da regolamento del corso di studi.

Course includes theoretical lessons and laboratory activities.

The module includes18 hours of frontal lessons, 20 hours of laboratory activities (five sessions of 4 hours) for an experimental procedure consisting in the purification and characterization of a recombinant protein (with a final report that will be rated), and 8 hours (4 hours each session) of open-day laboratory in which students may manage laboratory activities.

Attendance at theoretical lessons is optional but strongly encouraged, attendance at laboratory activities is recommended to be 100% (any overlap with concomitant courses/ laboratories will be taken into account in the timetable planning). In any case, attendance must be higher than 75%, according to the course guidelines.

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Modalità di verifica dell'apprendimento

L’apprendimento verrà verificato attraverso una prova scritta comune nella quale gli studenti verranno valutati sia per il modulo di Metodologie Biochimiche che per il modulo di Microbiologia Applicata. Gli appelli della sessione autunnale e primaverile saranno orali.

Esame scritto di Metodologie Biochimiche: l’esame sarà costituito da tre domande semi-strutturate (4 punti ciascuna, su aspetti tecnici e teorici di cromatografia, spettroscopia e elettroforesi inclusi problemi sperimentali) e da 4 domande a scelta multipla (1 punto ciascuna, su nozioni base delle tecniche) per un totale complessivo di 16 punti. Ulteriori 16 punti saranno così suddivisi: 12 punti per la relazione di laboratorio e 4 punti per il quaderno di laboratorio.

Voto complessivo: è costituito dalla media ponderata dei punteggi in trentesimi riportati per i singoli moduli. Lo studente che ha superato l’esame potrà richiedere il miglioramento del suo voto con una domanda orale.

Esame orale nelle sessioni autunnali/primaverili: lo studente verrà valutato mediante 3 domande per modulo sulle attività di laboratorio svolte (con esercizi pratici da svolgere) e sulle nozioni impartite durante le lezioni frontali. Il voto sarà espresso in trentesimi e sarà rappresentato dalle medie ponderate delle votazioni inerenti ai due moduli.

Students will be evaluated by an overall written test for both the Biochemistry and Microbiology module. Autumn and spring sessions will be oral.

 Biochemistry Methods Exam: three semi-structured questions (4 points each, on technical and theoretical aspects of chromatography, spectroscopy and electrophoresis including experimental problems) and 4 multiple choice questions (1 point each, basis of learned techniques) (16 overall points). Additional 16 points will be divided as follows: 12 points for lab report and 4 points for the laboratory student book.

Overall score: average score of individual modules. Improvement of the overall score may be performed with oral questions.

Oral exam in autumn/spring: three questions per module regarding both lessons and laboratory activities. The average of both modules will compose the overall score.

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Programma

- Introduzione:  composti biologici da analizzare e caratterizzare. Condizioni da rispettare in vitro (pH, forza ionica, condizioni redox, viscosità, ecc.);
- Soluzioni tampone: calcoli e preparazione con esempi in aula e con esercitazione pratica di 4 ore;
- Tecniche di estrazione di macromolecole: tessuti animali e vegetali (tecniche di omogeneizzazione), organismi monocellulari (colture microbiche). Metodi di recupero di proteine esocellulari, endocellulari e di membrana. Tecniche di lisi di pareti e  membrane;

- Solubilità delle proteine e tecniche di precipitazione. Centrifugazione e ultracentrifugazione: applicazioni per tecniche preparative e cenni alle applicazioni analitiche. Filtrazione, dialisi, concentrazione del campione. Congelamento e liofilizzazione;

- Tecniche cromatografiche: cromatografia su strato sottile. Matrici cromatografiche per LC, FPLC, HPLC, vantaggi e svantaggi d’uso e applicazioni. Cromatografie su colonna: scambio ionico, interazioni idrofobiche, gel filtrazione, affinità (con esercitazione pratica di 4 ore), cromatofocusing. HPLC (con esercitazione pratica di 4 ore), FPLC, gas-cromatografie. Esempi di applicazione tramite la presentazione di dati sperimentali;

- Utilizzo di tecniche spettrofotometriche, richiamo alla legge di Lambert- Beer.
Saggi colorimetrici di uso comune. Metodi di dosaggio proteico e di valutazione dell’attività enzimatica (con esercitazione pratica di 4 ore);

- Tecniche elettroforetiche, SDS-PAGE (con esercitazione pratica di 4 ore), isoelettrofocalizzazione, elettroforesi bidimensionale, tecniche di densitometria, elettroeluizione, blotting ed elettroblotting. Colorazioni specifiche e aspecifiche per elettroforesi di proteine e glicoproteine. Cenni al Western blotting;

- Utilizzo di tecniche spettroscopiche in biochimica per studi teorici e applicazioni (dicroismo circolare, fluorescenza, NMR, EPR, spettroscopia di assorbimento atomico, IR, Raman) con basi elementari della tecnica e enfasi sulle informazioni ottenibili da ciascuna tecnica tramite numerosi esempi.

-       Sample preparation for biochemical analysis, protein compatible buffers (4 h practical) and detergents. Purification of intracellular and extracellular proteins.

-       Protein solubility and precipitation techniques. Filtration, dialysis

-       Chromatography: IEXC, gel filtration. Cutting-edge chromatography techniques for protein purification (affinity chromatography with 4 h practical), HPLC (4 h practical), FPLC, gas-cromatography. Analysis of experimental data.

-       Lambert-Beer Law and spectrophotometric assays for protein quantitation (Lowry, Bradford, Bicinchonic Acid ) and for enzyme activity. (4 h practical)

-       Electrophoresis techniques for purity check. SDS-PAGE, (4 h practical) IEF and 2D electrophoresis for proteomics. Protein blotting and decoration

-       Spectroscopy for protein 2ary and 3ary structure studies (CD, fluorescence, NMR, EPR, AS, IR, Raman): application and basis of structural/functional data obtained. Discussion on experimental protocols with practicals on data analysis.

Testi consigliati e bibliografia

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Il materiale didattico presentato a lezione è disponibile sul sito del corso.
Testi consigliati:

R. Reed, D. Holmes, J. Weyers, A. Jones. Metoidologie di base per le scienze biomolecolari. Zanichelli (2002)

IC Wilson, J. Walker. Metodologia biochimica: le tecniche biochimiche in laboratorio. Ed. Raffaello Cortina (1995).
R.L. Dryer, G.F. Lata. Metodologia biochimica Ed. Delfino (1993).

Slides, protocols and technical details are available on the course website
Reference textbooks:

R. Reed, D. Holmes, J. Weyers, A. Jones. Metoidologie di base per le scienze biomolecolari. Zanichelli (2002)

IC Wilson, J. Walker. Metodologia biochimica: le tecniche biochimiche in
laboratorio. Ed. Raffaello Cortina (1995).
R.L. Dryer, G.F. Lata. Metodologia biochimica Ed. Delfino (1993).



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Ultimo aggiornamento: 15/06/2018 16:57
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